- 邓舒予;尹萌;应铸;刘晶;刘群;
线粒体转铁蛋白(MIT)是真核生物中一类关键的铁离子转运蛋白,在维持细胞内铁离子稳态和氧化还原平衡中发挥重要作用。本试验将酵母MIT的氨基酸序列在弓形虫数据库中进行同源序列比对,获得了弓形虫中的同源蛋白TgMIT。为研究TgMIT蛋白在弓形虫中的定位和功能,利用成簇规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建TgMIT内源性标记虫株(TgMIT-3HA虫株),通过聚合酶链式反应(PCR)、蛋白免疫印迹(WB)和免疫荧光分析(IFA)进行鉴定,采用IFA探究TgMIT蛋白的定位,WB探究不同铁离子环境对TgMIT蛋白相对表达量的影响;构建基因敲除虫株(Δmit虫株)并通过PCR进行验证,采用噬斑试验、入侵试验和增殖试验分析TgMIT蛋白对弓形虫生命活动的影响,通过检测活性氧(ROS)水平、还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值,探究Δmit虫株的氧化还原状态。结果显示,TgMIT-3HA虫株构建成功;TgMIT蛋白定位于虫体质膜;与未处理组相比,低铁环境中TgMIT蛋白相对表达量显著下调(P<0.01),高铁环境中其相对表达量极显著上调(P<0.001或P<0.000 1)。Δmit虫株构建成功,mit基因缺失极显著抑制虫体噬斑形成能力(P<0.000 1)、入侵能力(P<0.001)和增殖能力(P<0.000 1),并导致虫体氧化应激,表现为ROS水平极显著升高(P<0.01),GSH/GSSG比值显著降低(P<0.05)。综上所述,TgMIT蛋白定位于弓形虫质膜,是一种铁离子调控相关蛋白,对维持氧化还原平衡和虫体正常生命活动至关重要。
2025年10期 v.61 1-8页 [查看摘要][在线阅读][下载 1863K] [下载次数:32 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:11 ] - 陈文轩;索静霞;孔嘉华;葛晓敏;裘鑫珠;汤新明;余芳;索勋;刘贤勇;
补体成分C5a作为免疫调节分子,近年已被证实可作为分子佐剂应用于新型疫苗开发。为了探索C5a作为球虫活载体疫苗分子佐剂的可行性,本试验通过同源序列比对和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增兔补体C5a基因,并通过生物信息学方法对兔C5a序列和C5a蛋白质二、三级结构进行预测和分析;构建包含兔出血症病毒1型(RHDV1)的VP60蛋白P2亚域基因和C5a基因的质粒,通过子孢子核转染和在家兔体内连续传代获得转基因早熟大型艾美耳球虫,采用聚合酶链式反应(PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)对该转基因虫株进行鉴定。结果显示,兔C5a基因大小为222 bp,与人、猪和牛的C5a核苷酸序列同源性为71.2%~77.0%,与小鼠和大鼠的C5a核苷酸系列同源性为68.5%。预测结果显示,C5a是主要由4个α螺旋构成的单体蛋白,含有过敏毒素同源结构域。本试验获得了第1代发荧光的卵囊并连续传代至第15代,其中第9代转基因虫株的发光率最高(39.5%,满足鉴定阈值),对其鉴定结果显示,P2-C5a基因已成功插入并在虫株中表达,表达的P2-C5a融合蛋白主要定位于子孢子胞浆中。结果表明,转基因早熟大型艾美耳球虫初步构建成功,为后续进行C5a在转基因早熟大型艾美耳球虫中的佐剂效应研究提供了材料。
2025年10期 v.61 9-17页 [查看摘要][在线阅读][下载 2382K] [下载次数:12 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:7 ] - 黎焕松;刘凯;张星坦;牛康;尚超;刘子睿;张翠玲;李玥;蒋琦炜;李霄;
猴痘病毒(MPXV)可以通过影响宿主代谢途径促进自身复制,为了深入阐明宿主代谢物谷氨酰胺(Gln)对MPXV复制的影响,本试验采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)、噬斑形成试验和Western blot方法,分别从病毒载量、病毒滴度和病毒蛋白(A5L和A29L)表达3个层面上检测了Gln干预对MPXV复制的影响,同时采用Western blot检测了MPXV对Gln代谢途径关键蛋白谷氨酸脱氢酶1(GLUD1)蛋白表达的影响。结果显示,与Gln~+MPXV~+组相比,Gln~-MPXV~+组MPXV载量极显著下降(P<0.000 1),滴度极显著下降(P<0.01),A5L和A29L蛋白表达水平极显著下降(P<0.000 1或P<0.01);Gln~(++) MPXV~+组MPXV的载量、滴度、A5L和A29L蛋白表达水平均无显著变化(P > 0.05),表明缺乏Gln能够显著抑制MPXV复制,而补充Gln对病毒复制无明显影响。MPXV能够显著抑制GLUD1蛋白表达(P<0.05),提示GLUD1很可能是MPXV影响宿主Gln代谢的作用靶蛋白之一。本试验结果表明,阻断Gln摄取可能成为MPXV预防和治疗的潜在方式,为后续开发更为有效的MPXV预防和治疗手段提供了科学依据。
2025年10期 v.61 18-24页 [查看摘要][在线阅读][下载 1522K] [下载次数:21 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:3 ] - 储丽宇;薛希彤;苗云博;唐国瑞;文晓晓;王学富;赵海鹏;侯江;芮萍;杨姗姗;王丽丽;李封赛;马增军;宋涛;
为获取猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的特异性纳米抗体,本试验构建了表达FIPV重组三聚体刺突(RS)蛋白的真核质粒pCAGGS-FIPV-RS,利用人胚胎肾293悬浮细胞(HEK293F)表达并纯化FIPV RS蛋白;以纯化的FIPV RS蛋白作为包被抗原,利用噬菌体展示技术,从天然噬菌体展示文库中筛选出序列不同的纳米抗体基因;构建纳米抗体真核表达载体pCAGGS-VHH-Fc,利用人胚胎肾293贴壁细胞(HEK293T)进行试表达,通过蛋白免疫印记试验(Western blot)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选能正常表达且具有高亲和力的纳米抗体,利用HEK293F细胞表达并纯化高亲和力的纳米抗体,通过间接免疫荧光试验(IFA)鉴定纯化后的纳米抗体与RS蛋白的反应原性。结果显示,本试验成功表达并纯化了FIPV RS蛋白;经过3轮噬菌体淘选后随机挑取41个阳性单克隆菌落,经测序分析,共筛选出10株序列不同的纳米抗体;成功构建pCAGGS-VHH-Fc重组真核表达质粒。Western blot和间接ELISA结果显示,其中7株纳米抗体与FIPV RS蛋白具有较好的反应原性;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实了这7株纳米抗体在HEK293F细胞中成功大量表达和纯化;IFA结果显示,其中5株纳米抗体能够特异性结合FIPV RS蛋白。本试验可为FIPV的诊断、治疗和致病机理研究提供参考。
2025年10期 v.61 25-32页 [查看摘要][在线阅读][下载 3039K] [下载次数:57 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:6 ] - 苏五珍;李中波;刘伟;
为探究湖南省中部和西部地区山羊源肝片吸虫的遗传多样性,分析其核糖体、线粒体基因序列特征,并阐明虫株之间的遗传进化关系,本试验以分离于湖南省张家界、湘西、怀化、邵阳、永州和娄底地区的36株山羊源肝片吸虫为样品,对其18S核糖体RNA(18S rRNA)、内转录间隔Ⅰ区(ITS-1)、内转录间隔Ⅱ区(ITS-2)、线粒体细胞色素C氧化酶I亚基(cox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶I亚基(nad1)基因进行PCR扩增和测序,以分析5个基因的序列特征及其种内和种间差异,绘制遗传进化树以阐明其遗传进化关系。结果显示,肝片吸虫的18S rRNA、ITS-1、ITS-2、cox1和nad1基因序列长度分别为585、453、360、676和903 bp;其中,肝片吸虫18S rRNA、ITS-1基因序列呈碱基GC偏好,而ITS-2、cox1和nad1基因序列却呈碱基AT偏好;肝片吸虫18S rRNA、ITS-1、ITS-2、cox1和nad1基因的种内差异分别为0~1.0%、0~2.0%、0~0.3%、0~2.7%和0~1.7%,种间差异分别为0.68%~1.85%、0.44%~3.52%、1.11%~9.44%、1.48%~13.46%和8.31%~14.51%;遗传进化分析发现,来源于湖南省张家界、吉首、怀化、邵阳、永州和娄底地区的36株山羊源肝片吸虫均聚类在同一分支。结果表明,湖南省中部和西部地区山羊源肝片吸虫个体之间虽存在低程度的遗传多样性,但具有较近的亲缘关系,且ITS-2和nad1基因可作为片形吸虫种间研究的遗传标记。
2025年10期 v.61 33-41页 [查看摘要][在线阅读][下载 1659K] [下载次数:23 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:6 ] - 李思颖;王亚楠;曹杰;周勇志;张厚双;王瑞;周金林;
为了解中蒙边境内蒙古口岸地区蜱种及其携带蜱传病原的情况,本试验于2023—2024年在中蒙边境内蒙古8个口岸地区采集游离蜱1 470只,经形态学鉴定确定蜱种,并分别基于23S rRNA和18S rRNA基因对蜱体无形体和梨形虫进行分子学检测。结果显示,采集到的硬蜱涉及4属7种,按占比从高到低分别为草原革蜱、全沟硬蜱、亚洲璃眼蜱、麻点璃眼蜱、阿坝革蜱、嗜麝血蜱和森林革蜱,不同口岸地区分布的蜱种有所不同。从蜱体检测到4种无形体,分别为鼠埃立克体、米库伦新埃立克体、嗜吞噬细胞无形体和绵羊无形体,总感染率为12.59%(185/1 470),8个口岸蜱体无形体感染率介于0~26.92%,各口岸蜱体携带的无形体感染率存在极显著差异(χ~2=51.330,P<0.001),以绵羊无形体感染率为最高(6.53%)。从蜱体检测到5种梨形虫,分别为绵羊泰勒虫、马泰勒虫、田鼠巴贝斯虫、驽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫,总感染率为13.27%(195/1 470),各口岸蜱体梨形虫感染率介于0~30.59%,各口岸蜱体携带的梨形虫感染率存在极显著差异(χ~2=232.598,P<0.001),以田鼠巴贝斯虫感染率最高(10.07%)。在蜱体中普遍存在无形体和梨形虫共感染的现象。本试验结果不仅对中蒙边境内蒙古口岸地区蜱种及其携带蜱传病原多样性起到一定的补充作用,也为蜱和蜱传病的防控工作提供了相关参考。
2025年10期 v.61 42-49页 [查看摘要][在线阅读][下载 1374K] [下载次数:31 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:2 ] - 郭生革;
为了分析2020—2024年北京市猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况和遗传变异特征,本试验从北京市8个地区的不同规模猪场采集了6 127份临床样本,利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测PRRSV感染情况,通过PCR扩增获得PRRSV的开放阅读框5(ORF5)序列,并基于ORF5基因进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,2020—2024年北京地区样本PRRSV总检出率为16.35%(1 002/6 127),不同年度的PRRSV检出率呈逐年下降趋势;不同地区的PRRSV检出率介于10.31%~22.84%,其中延庆区的检出率最高;不同样本类型的PRRSV检出率不同,其中肺脏样本的检出率最高,为22.54%(222/985),环境样本的检出率较低,为3.72%(16/430),种公猪精液中未检出PRRSV。本试验测序获得26个PRRSV ORF5基因序列,通过系统进化分析发现,北京地区检测到的PRRSV毒株主要属于谱系1.8(NADC30-like)和1.5(NADC34-like),占比分别为42.31%(11/26)和34.62%(9/26),此外,谱系5(VR2332-like)和谱系8(HP-PRRSVlike)也有少量分离毒株分布。本试验揭示了北京市PRRSV-2的流行特性和遗传多样性,为制定针对性防控措施提供了科学依据。
2025年10期 v.61 50-57页 [查看摘要][在线阅读][下载 1528K] [下载次数:179 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:0 ] - 张阳;王胜华;赵文昌;
为了明确甘肃省某猪场发病猪病原及其相关生物特性,本试验采集临床发病猪心脏、肝脏、脾脏和关节液组织并进行病原分离和革兰染色,采用16S rRNA测序和血清分型鉴定菌株,并分析其毒力基因、药敏结果、生长曲线、致病性和免疫原性。结果显示,分离到1株猪链球菌3型,命名为LZS3。分离菌株LZS3携带epf、mrp和sly三种毒力基因;药敏试验结果显示,该菌株对左氧氟沙星、氟苯尼考和环丙沙星耐药,对阿莫西林和头孢噻吩敏感;生长曲线显示,LZS3培养8 h达到生长高峰;在小鼠感染模型中,LZS3以2.5×10~8 CFU/只剂量感染小鼠可致其全部死亡,显示强致病性;利用铝胶和GEL02佐剂制备的灭活疫苗对小鼠保护率达90%~100%。结果表明,感染分离菌株LZS3治疗首选阿莫西林,LZS3免疫原性优异,可作为候选疫苗株,为猪链球菌3型的防治提供科学支撑。
2025年10期 v.61 58-63页 [查看摘要][在线阅读][下载 1512K] [下载次数:29 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:2 ] - 王蔼甜;何晓政;柴宇昊;刘心怡;胡增垒;
为比较新城疫病毒弱毒株La Sota经不同途径接种对鸡的感染性差异,本试验首先对La Sota株的生物学特性进行鉴定,并通过饮水和滴鼻点眼途径接种La Sota株,对病毒的组织嗜性、病毒载量、排毒情况和机体抗体应答水平进行测定。结果显示,La Sota株经饮水和滴鼻点眼途径接种均不引起2周龄无特定病原体(SPF)鸡的临床症状和病理变化;病毒经2种途径接种后可在鸡的多种脏器中复制,病毒载量为10~(1.2)~10~(3.4) copies/μg;呼吸道和消化道中均未检测到病毒;接种后第7天,滴鼻点眼组和饮水组的血凝抑制(HI)抗体效价分别为2~(7.2)和2~(4.2),差异显著(P<0.05),接种后第14天,滴鼻点眼组和饮水组的HI抗体效价分别为2~(6.2)和2~(7.8),显著不差异(P > 0.05)。结果表明,经饮水与滴鼻点眼途径接种La Sota株,病毒均可在多个组织中复制,不能从呼吸道和消化道排毒,可诱导产生较高的HI抗体水平。本试验为临床中科学选择新城疫弱毒活疫苗的投放方式提供了参考。
2025年10期 v.61 64-70页 [查看摘要][在线阅读][下载 1672K] [下载次数:10 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:3 ] - 郑良益;冯钊;王治江;万佳;柏娇;张敏;沈海峰;陈武卫;周平;刘项羽;谢红玲;孙文;
为评估猪瘟兔化弱毒疫苗(简称C株疫苗)和猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗(简称E2疫苗)的免疫效果以及母源抗体水平对仔猪猪瘟疫苗免疫效果的影响,本试验将65头25~30日龄仔猪分为6个免疫组(A~F组,10头/组)和1个空白对照组(G组,5头)。A组在母源抗体转阴时(60日龄)单次接种C株疫苗;B、C、D、E、F组实施2次免疫,其中B组全程使用C株疫苗;C组采用C株疫苗与自制E2疫苗混合免疫(含30μg E2蛋白);D组首免C株疫苗,二免自制E2疫苗;E组全程使用自制E2疫苗(含30μg E2蛋白);F组接种商品化E2疫苗(含50μg E2蛋白);G组注射生理盐水作为对照。结果显示,A组在接种后42~150 d抗体阳性率维持100%;B组(25~30日龄首免)受母源抗体干扰,最高阳性率仅40%;C组二免后122 d抗体阳性率为50%;D组和E组分别在二免后32~152 d和首免后28 d~二免后152 d抗体阳性率维持100%;F组在二免后152 d抗体阳性率下降至66.67%;所有试验组免疫效果均显著优于空白对照组(G组试验期内抗体阳性率均为0)。结果表明,母源抗体显著影响免疫效果,而组合免疫策略效果较好。母源抗体阳性时,推荐50~60日龄单次接种C株疫苗;若需25~30日龄首免,应采用C株疫苗首免、E2疫苗加强的免疫程序,其保护期可达180 d;商品化E2疫苗单独使用保护期可达150 d。
2025年10期 v.61 71-76页 [查看摘要][在线阅读][下载 1109K] [下载次数:27 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:3 ]