- 康浩然;黄雨薇;宋程;高鹏;张永宁;周磊;盖新娜;韩军;郭鑫;杨汉春;
猪肺炎支原体（Mhp）是引起猪支原体肺炎（MPS）的病原，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。早期快速诊断和实时监测对该病的防控至关重要，目前常用的核酸检测方法难以满足临床上即时检测（POCT）的实际需求。本试验针对Mhp细胞膜表面脂蛋白基因p46，通过序列比对和系统性的引物筛选设计了exo探针及其对应的重组酶介导的等温扩增（RAA）技术引物对，建立了Mhp实时荧光（real-time）RAA快速检测方法；随后，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测，并使用该方法和实时荧光定量PCR(qPCR)对比检测临床样本。结果显示，该方法与猪链球菌、肺炎克雷伯氏菌、猪格拉瑟氏菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌均无交叉反应，特异性好；Mhp real-time RAA及其可视化方法的检测敏感性分别为18和29 copies/μL(95%置信区间)，敏感性强；组内和组间重复性试验变异系数均小于8.0%，重复性好；对108份猪临床样本的检测结果显示，该方法及其可视化方法与Mhp qPCR方法的符合率分别为98.15%和99.07%。本试验所建立Mhp real-time RAA方法可以通过便捷式蓝光仪器实现结果的可视化，更适用于资源匮乏的诊断实验室和基层现场，为MPS的防控提供了技术手段。
2025年09期 v.61 1-9页 [查看摘要][在线阅读][下载 2693K] [下载次数：59 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：21 ] - 张宇;张海洋;张国良;吴营霞;高盛果;孙哲;田克恭;
为了解国内猪场多杀性猪巴氏杆菌（Pm）的流行状况和流行菌株的致病力。本试验通过对河南省、浙江省和江苏省3个省份不同猪场中疑似感染Pm的病猪鼻拭子和肺组织病料进行病原菌分离培养和革兰染色镜检、生化鉴定、PCR分型鉴定、药敏试验、小鼠致病性试验和仔猪致病性试验。结果显示，共分离到Pm血清型A型4株，D型2株；6株分离菌株对多黏菌素B、多西环素、恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素和头孢噻呋均表现为敏感，对杆菌肽、克林霉素和林可霉素均表现为耐药；通过小鼠致病性试验筛选出强毒株P1971-A菌株；仔猪致病性试验结果显示，1×10~7 CFU/头的剂量可造成40%仔猪发病，1×10~9 CFU/头的剂量可造成100%仔猪发病和60%仔猪死亡，发病仔猪可见不同程度的精神不振、食欲降低、卧地不起和呼吸困难等典型临床症状，剖检死亡猪可见气管白色泡沫和肺部气肿等典型病变。结果表明，本试验成功分离到4株A型Pm和2株D型Pm，为当前我国Pm流行血清型、菌株的致病力分析和相关疫苗研发提供了参考依据。
2025年09期 v.61 10-17页 [查看摘要][在线阅读][下载 1691K] [下载次数：41 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：10 ] - 黄禹丰;吴睿智;徐璐;邹兴启;车斯琪;李芳韬;夏应菊;赵俊杰;赵启祖;刘业兵;贾伟新;朱元源;
研制猪瘟病毒（CSFV）E~(rns)结构蛋白单克隆抗体（简称“单抗”），对研究E~(rns)抗原结构和建立CSFV诊断方法具有重要意义。本试验利用单个B细胞抗体技术制备系列单抗，用CSFV E~(rns)蛋白免疫BALB/c小鼠，通过流式分选技术分选特异性结合E~(rns)蛋白的单个B细胞，利用巢式聚合酶链式反应（PCR）扩增IgG抗体重链和轻链可变区基因，分别构建IgG抗体重链和轻链完整基因重组质粒，然后将重链和轻链重组质粒共转染至人胚胎肾细胞（HEK-293T）中进行单抗表达、纯化，并对单抗进行蛋白免疫印记（WB）、间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光（IFA）鉴定。流式分选结果显示，本试验分选得到48个特异性结合E~(rns)蛋白的单个B细胞。PCR扩增结果显示，从48个B细胞中扩增得到16对配对的IgG抗体重链和轻链可变区基因。WB、间接ELISA和IFA结果显示，本试验成功制备得到13株能与CSFV发生反应的E~(rns)单抗，其中1株（E0M11）仅与CSFV疫苗毒株（HCLV株、Thiverval株）反应，不与CSFV流行毒株（IVDC-HeB-01、IVDC-HuB-06）和牛流行性腹泻病毒（BVDV）反应。结果表明，本试验建立了快速筛选CSFV单抗的技术平台，制备的单抗有望用于CSFV鉴别诊断方法的建立，具有一定的临床应用价值。
2025年09期 v.61 18-27页 [查看摘要][在线阅读][下载 2575K] [下载次数：31 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：5 ] - 周凯仁;何源;董朕;吴灵玉;翟斌涛;王玮玮;程富胜;李冰;魏小娟;周绪正;张继瑜;
为了筛选盐酸恩诺沙星颗粒治疗自然感染细菌性猪呼吸道疾病（SRD）的合理有效剂量，本试验通过临床诊断、病理剖检和细菌分离筛选150头自然感染细菌性SRD的杜长大三元杂交猪，随机分为5个组，即高剂量（HDG）组、中剂量（MDG）组、低剂量（LDG）组、药物对照（TFP）组和感染对照（ICG）组，HDG、MDG和LDG组试验猪分别口服给予10.0、7.5和5.0 mg/（kg·bw）包被的盐酸恩诺沙星颗粒，拌料给药1次，对于严重或慢性SRD病例，48 h后补充给药1次；TFP组给予延胡索酸泰妙菌素预混剂，87.5 g/1 000 kg饲料混饲，连续给药10 d;ICG组不给予任何药物。试验期间（0～24 d）每日观测各组试验猪的体重和临床症状；试验前（0 d）和试验后（24 d）检测体重，并采集鼻拭子进行细菌分离和鉴定；试验期间对病死猪进行剖检和病理学检查；分析试验后各给药组的治愈率。结果显示，所筛选的试验猪均有食欲不振、咳嗽、消瘦和体温升高等症状；与ICG组相比，各给药组试验猪体重均显著增加（P<0.05），体温均显著减低（P<0.05）；试验前各组试验猪鼻拭子均分离到了1种或多种SRD相关病原菌，包括胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和副猪格拉瑟菌等，且细菌分离率基本一致；试验后，除TFP组多杀性巴氏杆菌检出率无显著差异（P > 0.05），其余给药组猪鼻拭子中的各病原菌检出率均显著降低（P<0.05）；试验期间HDG和LDG组各死亡2头，ICG组死亡4头，MDG和TFP组无死亡，病死猪剖解后表现为严重肺炎，肺间质水肿、出血，炎性细胞浸润，肺泡代偿性扩张明显；HDG、MDG和LDG组治愈率分别为86.7%、83.3%和60.0%,TFP组为86.7%。结果表明，包被的盐酸恩诺沙星颗粒以7.5 mg/（kg·bw）剂量拌料给药，严重或慢性呼吸道疾病猪48 h后补充给药1次，对治疗自然感染细菌性SRD效果最佳。因此，包被的盐酸恩诺沙星颗粒以7.5 mg/（kg·bw）剂量作为临床推荐剂量使用，能有效治疗由细菌引起的SRD、减轻疾病造成的损失、降低死亡率和节省人力物力。
2025年09期 v.61 28-35页 [查看摘要][在线阅读][下载 1381K] [下载次数：13 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：7 ] - 屈玮钰;李鑫;
伪狂犬病病毒（PRV）是α疱疹病毒家族成员，其独特短区1(US1)基因在病毒生命周期中发挥关键作用，但US1在PRV中的功能研究尚不充分。本试验旨在构建PRV US1基因缺失株（PRV-ΔUS1），并探究其生物学特性。首先，通过蛋白表达纯化和动物免疫方法制备鼠源PRV US1多克隆抗体，并利用成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建PRV-ΔUS1，通过聚合酶链式反应（PCR）和蛋白质印迹法（WB）进行验证；然后，采用蚀斑试验、病毒生长曲线测定和连续传代遗传稳定性试验分析PRV-ΔUS1的生物学特性。结果显示，成功制备鼠源PRV US1多克隆抗体；经PCR和WB验证，PRV-ΔUS1成功缺失US1基因；与野生型毒株相比，PRV-ΔUS1的蚀斑直径极其显著缩小（P<0.001）,6、12、24和48 h各个时间段的体外增殖能力均极其显著减弱（P<0.001），且在多次传代中保持遗传稳定性。结果表明，本试验成功构建PRV-ΔUS1，并证实US1基因可影响PRV的蚀斑形成和增殖能力，为PRV US1基因的功能研究和新型疫苗研发提供了重要工具和理论基础。
2025年09期 v.61 36-43页 [查看摘要][在线阅读][下载 1522K] [下载次数：34 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 郭宏伟;刘妍;赵绪永;龚婷;马辉;刘薇;郑鸣;
为了探究猪氨基肽酶N(pAPN)病毒结合受体功能区域与传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的结合活性，本试验采用重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）技术将pAPN胞外区分为5段并与Fc片段融合，构建酵母分泌表达载体pPICZαA-pAPN-Fc进行融合表达，在分子和细胞水平对比分析5个Fc融合蛋白与PEDV和TGEV结合能力及对病毒核衣壳蛋白（N）基因mRNA转录和复制的影响，筛选潜在病毒结合受体功能关键区。结果显示，pAPN_1-Fc、pAPN_2-Fc、pAPN_3-Fc、pAPN_4-Fc和pAPN_5-Fc共5个融合片段均可在毕赤酵母X33中高效分泌表达，并可与pAPN兔多克隆抗体特异性结合。PEDV和TGEV结合活性酶联免疫吸附试验（ELISA）分析结果显示，pAPN_2-Fc、pAPN_3-Fc、pAPN_4-Fc、pAPN_5-Fc融合蛋白具有不同程度的PEDV和TGEV结合活性，且同种融合蛋白与TGEV的结合能力高于PEDV，其中pAPN_2(574～678aa)和pAPN_3(669～773aa)区域与病毒的结合能力较强。实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫荧光共聚焦试验结果显示，融合蛋白pAPN_2和pAPN_3-Fc抑制PEDV和TGEV N基因mRNA转录和复制的能力较强。结果表明，pAPN胞外区域574～773aa可同时结合PEDV和TGEV，并能抑制病毒N基因mRNA转录和复制能力，pAPN 574～773aa可能是PEDV和TGEV结合受体的共同关键区域。本试验结果可为PEDV和TGEV的感染机制研究及抗病毒药物设计提供理论依据。
2025年09期 v.61 44-52页 [查看摘要][在线阅读][下载 2218K] [下载次数：4 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：5 ] - 黄宁;黄心钰;姚瑶;原梦琪;刘平黄;
焦孔素（GSDM）家族成员焦孔素B(GSDMB)在感染性疾病、癌症和炎症性疾病中发挥关键调控作用。为了阐明猪GSDMB(pGSDMB)的组织分布、同源异构体特征及其功能活性，本试验采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测pGSDMB在不同细胞系和组织中的转录水平；通过PCR克隆并鉴定其同源异构体；结合生物信息学方法预测并分析其蛋白结构；采用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验和碘化丙啶（PI）染色评估其N端结构域的焦亡活性。qPCR结果显示，pGSDMB在猪回肠上皮细胞（IPI-2I）和猪肠道组织中高表达。本试验首次鉴定出pGSDMB存在pGSDMB2和pGSDMB3两种同源异构体。结构分析显示，与pGSDMB3相比，pGSDMB2缺失由21个氨基酸组成的结构区域（β-折叠结构和部分无规则卷曲区域）。功能试验证实，与空载体对照相比，pGSDMB N端1～245位氨基酸具有极显著焦亡活性（P<0.000 1），而缺失21个氨基酸的pGSDMB N端1～222位氨基酸则丧失该功能。综上所述，本试验检测了pGSDMB在不同细胞系和组织中的转录水平，揭示了其同源异构体的序列差异和结构特征，并确定了pGSDMB N端的焦亡活性区域（1～245位氨基酸区域），为深入理解pGSDMB的生物学功能及其在各种疾病中的作用提供了科学依据。
2025年09期 v.61 53-62页 [查看摘要][在线阅读][下载 4226K] [下载次数：10 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 李钰婷;王衡平;李芳;周昕;王会岩;
为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳（N）蛋白的单克隆抗体。本试验构建和鉴定重组表达质粒pET28a(+)-sumo-N，以原核表达并纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠，应用单B细胞筛选技术获得分泌针对N蛋白的特异性抗体的单B细胞，再经单细胞测序获得抗体基因序列并构建真核表达质粒，利用中华仓鼠卵巢（CHO）细胞瞬时转染表达并筛选和纯化单克隆抗体，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其效价，蛋白质免疫印迹（WB）鉴定其特异性，生物膜干涉（BLI）技术测定其亲和力和表位分组。结果显示，N蛋白呈可溶性表达，分子量约34 kDa。基于单B细胞筛选技术筛选出5株单克隆抗体。5株单克隆抗体效价均大于10~5，均可与PRRSV N蛋白产生特异性反应，亲和力解离常数（Kd）分别为8.72×10~(-9)、1.41×10~(-8)、1.14×10~(-10)、1.00×10~(-12)和1.54×10~(-11) mol/L，且表位均不相同。本试验应用单B细胞筛选技术成功制备出抗PRRSV N蛋白的特异性单克隆抗体，为进一步研究PRRSV N蛋白的结构特性、功能作用以及建立高效且快速的PRRSV抗体检测方法提供参考。
2025年09期 v.61 63-70页 [查看摘要][在线阅读][下载 2484K] [下载次数：56 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 陈登金;李鹏宇;董楠;常昊天;胡渤;肖进;张蕾;马良;
为实现对猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）的同时鉴别检测，本试验根据PEDV核衣壳蛋白（N）基因、PoRV结构蛋白6(VP6)基因和PDCoV基质蛋白（M）基因筛选设计3对特异性引物和荧光标记探针，通过矩阵法优化反应条件，建立多重荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，绘制标准曲线，验证该方法的特异性、敏感性和重复性，并进行临床样本检测。标准曲线拟合试验结果显示，PEDV、PoRV和PDCoV多重荧光定量RT-PCR方法针对各病毒扩增均具有良好的相关系数和扩增效率；特异性试验结果显示，该方法仅对PEDV、PoRV和PDCoV呈现特异性扩增，不与其他猪源病毒发生交叉反应；敏感性试验结果显示，该方法对PEDV、PoRV和PDCoV的最低检测限均为1×10~0 copies/μL；组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2%，具有良好的重复性。对367份临床样本进行PEDV、PoRV和PDCoV检测，多重荧光定量RT-PCR检测的阳性率为92.37%(339/367)，而地方标准多重RT-PCR检测的阳性率为83.38%(306/367),2种方法临床样本检测符合率为91.01%(334/367)。结果表明，本试验建立了一种可快速、准确、灵敏检测PEDV、PoRV和PDCoV的多重荧光定量RT-PCR方法，可用于实验室病原和临床样本检测，为临床猪病毒性腹泻的研究和防控提供了有效技术方法。
2025年09期 v.61 71-78页 [查看摘要][在线阅读][下载 3272K] [下载次数：56 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 饶丹;秦锋;阮梦凡;葛雨;张明旭;杨喜梅;李美佳;陈文雪;于林洋;赵攀登;胡静;刘向楠;郑全芳;董建国;
为了研究猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况，本试验对2023年9月河南省西平县某规模化猪场疑似感染PEDV的腹泻猪进行样品采集、PCR鉴定、病毒分离、间接免疫荧光鉴定和电子显微镜观察，并对病毒重要基因进行测序分析。结果显示，成功分离得到1株PEDV毒株，命名为HNxp23。遗传进化分析结果显示，HNxp23毒株纤突蛋白基因S、膜蛋白基因M和辅助蛋白基因ORF3均与中国黑龙江分离毒株CH-HLJJS-2022位于同一分支，属于GⅡa亚型。氨基酸同源性分析结果显示，HNxp23毒株S和ORF3蛋白与中国黑龙江分离毒株CH-HLJJS-2022同源性最高，分别为98.7%和99.4%;M蛋白与中国北京分离毒株LZW同源性最高，为99.3%。S蛋白氨基酸抗原表位分析结果显示，与CV777毒株相比，HNxp23毒株S蛋白在抗原表位COE区、SS2区、SS6区和2C10区分别存在19、1、1和0个氨基酸差异。结果表明，本试验分离毒株HNxp23属于PEDV的GⅡa亚型，S蛋白在COE区易发生氨基酸突变。本试验结果可为河南地区PEDV的流行特征分析以及PEDV疫苗和药物的研发提供参考。
2025年09期 v.61 79-86页 [查看摘要][在线阅读][下载 2005K] [下载次数：57 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：5 ] - 刘逸龙;熊谋康;王淇;商琦;张乐宜;钟帆;苗俊好;宋长绪;徐铮;马晓莉;
为调查分析2023—2024年我国部分地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况，本试验采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测了9省42家猪场的806份疑似PEDV阳性样品，对阳性样品的PEDV刺突蛋白1(S1)、膜蛋白（M）和辅助蛋白（ORF3）基因进行反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增并测序，得到的代表毒株序列与参考毒株进行比对，构建遗传进化树，分析核苷酸序列相似性和氨基酸序列突变位点。结果显示，806份样品中检出阳性样品473份，样品阳性率为58.68%。共测序鉴定出10株PEDV代表毒株，其S1基因核苷酸序列的相似性介于97.4%～99.7%，均属于G2-2亚型；M基因核苷酸序列的相似性介于96.0%～100%，其中8株属于G2-2亚型，2株属于G2-1亚型；ORF3基因核苷酸序列的相似性介于95.6%～100%，其中8株属于G1-2亚型，1株属于G1-1亚型，1株属于G2-1亚型。与各亚型参考毒株相比，10株代表毒株的S1、M和ORF3基因均存在多个氨基酸位点突变。结果表明，2023—2024年我国部分地区猪群中PEDV感染情况较为严重，主要流行G2型毒株。
2025年09期 v.61 87-97页 [查看摘要][在线阅读][下载 2877K] [下载次数：80 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：7 ]